IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino – IST
Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro
Largo Rosanna Benzi, 10 16132 GENOVA
U.O.C. Genetica Medica
(Direttore: Prof. Paola Mandich)
Estensione dell'analisi molecolare del gene HSPB1
Introduzione
La malattia di Charcot-Marie-Tooth (CMT) comprende un gruppo di patologie ereditarie del Sistema Nervoso Periferico (SNP), che determinano, con meccanismi patogenetici diversi, un progressivo deterioramento delle fibre nervose. Si tratta della più frequente patologia neuromuscolare geneticamente determinata, con un’incidenza di 1:2500.
Le CMT sono caratterizzate da una elevata eterogeneità dal punto di vista sia clinico sia genetico e possono essere distinte sulla base della diversa modalità di trasmissione (autosomica dominante, recessiva o X-linked) e/o dei dati elettrofisiologici. Si distinguono classicamente due forme: demielinizzante (CMT1) e assonale (CMT2). Nelle CMT1 il danno a carico dei neuroni è primariamente localizzato all’avvolgimento mielinico (guaina mielinica) delle fibre nervose (assoni). In queste forme il danno causa un rallentamento della velocità di conduzione degli stimoli dal centro verso la periferia. Differentemente la forma assonale (CMT2) è causata da un danno primitivamente diffuso agli assoni determinando una diminuzione del numero e del calibro degli assoni che partecipano alla trasmissione dello stimolo. In queste forme la velocità di conduzione non è compromessa in modo rilevante ma l’intensità dello stimolo è diminuita in rapporto al numero di fibre perdute.
Le neuropatie motorie distali (dHMN) sono neuropatie ereditarie motorie pure, in cui vi è assenza del coinvolgimento sensitivo dal punto di vista sia clinico sia elettrofisiologico. Le dHMN, tuttavia, possono essere molto simili alle CMT assonali, a causa della frequente assenza di sintomi sensitivi nei pazienti CMT2. Un’accurata indagine elettrofisiologica è quindi essenziale per una corretta diagnosi differenziale. Le dHMN sono distinte sulla base della modalità di trasmissione (autosomica dominante, recessiva o X-linked) o sulla base del quadro clinico e dei segni associati presenti nei pazienti.
Le due differenti forme di neuropatia (CMT2 e dHMN) possono essere associate a mutazioni in un gruppo di geni , quali Heat Shock Protein 27 kDa (HSPB1), Heat Shock Protein 22 kDa (HSPB8), Glycil-tRNA Sinthethase (GARS) e, recentemente, Transient Receptor Potential Cation Channel, subfamily V, member 4 (TRPV4). Infatti mutazioni che colpiscono lo stesso gene in regioni diverse sono associate a quadri clinici e neurofisiologici diversi. Di conseguenza, si può ipotizzare una possibile sovrapposizione tra le due forme di neuropatia anche per quanto riguarda i meccanismi patogenetici associati.
Razionale
Il gene HSPB1 è stato associato a dHMN e CMT2 nel 2004 e sino ad ora sono state riportate in letteratura 13 mutazioni, con modalità di trasmissione autosomica sia dominante sia recessiva. Nell’ambito dell’attività di ricerca e di diagnostica dell’Unità Operativa di Genetica Medica dell’IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria S. Martino – IST di Genova, diretta dalla Prof.ssa Paola Mandich, sono stati recentemente reclutati 167 pazienti dHMN/CMT2 privi di diagnosi molecolare, al fine di valutare il ruolo di HSPB1 nella patogenesi di queste forme di neuropatia periferica ereditaria.
Lo studio si è focalizzato, in una prima fase, sulla ricerca di mutazioni nella porzione del gene codificante la proteina. Sono state individuate sette mutazioni in nove pazienti non correlati e, tra queste, quattro non erano state precedentemente associate a malattia. In questo studio l’analisi molecolare ha permesso la caratterizzazione genetica nell’8% dei pazienti dHMN e il 4% dei pazienti CMT2 studiati, permettendo un’appropriata valutazione del rischio di ricorrenza per il paziente e la famiglia. La frequenza di mutazione di HSPB1 osservata nella nostra casistica identifica questo gene, ad oggi, come il principale protagonista nella patogenesi delle forme di neuropatia prevalentemente motoria.
I dati ottenuti in questo studio sono stati recentemente accettati per la pubblicazione su una rivista scientifica internazionale (Journal of Peripheral Nervous System).
Scopo del progetto
Lo scopo di questo progetto consiste nell’estensione dell’analisi di HSPB1 ai casi dHMN/CMT2, privi di definizione molecolare, attraverso lo studio di altri meccanismi che possono sottendere la patologia. Il progetto si struttura in due fasi:
- Analisi molecolare del promotore
La regione promotrice è una zona coinvolta nella regolazione dell’espressione di un gene ovvero regola la quantità di proteina prodotta dal gene stesso.
In altre forme di CMT, il ruolo del promotore nella patogenesi del danno neuronale è stato ampiamente dimostrato come, per esempio, nelle forme di CMT associate al cromosoma X. Sono state infatti descritte otto mutazioni a livello della regione promotrice del gene GJB1, responsabile di questa forma di neuropatia periferica. Questo risultato ha introdotto lo studio del promotore di GJB1 nella diagnostica routinaria.
Il promotore di HSPB1 è stato studiato nel 2007 dal gruppo del Professor Vincent Timmerman. Lo studio (Nelis et al., 2007) ha identificato una variante, non precedentemente riportata, in un paziente con dHMN. Studi funzionali hanno successivamente dimostrato come questa alterazione compromettesse la corretta attività di questa regione genica, definendo il ruolo causale della variante identificata.
Questa prima parte del progetto si propone quindi di valutare la presenza di varianti rare a livello della regione promotrice di HSPB1 nei nostri pazienti.
- Analisi molecolare delle Copy Number Variations (CNVs)
La più frequente forma di neuropatia periferica ereditaria è la CMT1A, associata alla duplicazione del gene Peripheral Myelin Protein 22 (PMP22). L’introduzione o la perdita di una o più copie di un gene o di sue porzioni è definita CNV. Recentemente lo studio delle CNVs ha interessato anche altri geni coinvolti nelle CMT. In particolare sono stati pubblicati casi di delezioni in alcuni esoni del gene Mitofusin 2 (MFN2), la delezione dell’intero gene Gap Junction Beta-1 (GJB1) e la duplicazione del gene Myelin Protein Zero (MPZ).
Alla luce di questi risultati, la seconda parte del progetto si propone di valutare l’eventuale presenza di CNV anche nel gene HSPB1.
Implicazioni e ricadute dello studio nella diagnostica delle CMT
Questo progetto si propone di estendere lo studio del gene HSPB1 includendo, oltre la regione codificante, la regione promotrice e le CNVs. L’identificazione di nuove varianti patogenetiche amplierebbe la definizione molecolare di pazienti con dHMN e con CMT2 e potrebbe permettere il raggiungimento di una corretta diagnosi genetica in una percentuale maggiore di pazienti.
L’identificazione del difetto genetico responsabile della patologia permette una precisa definizione del rischio di ricorrenza e un’adeguata consulenza genetica al paziente e alla sua famiglia. La definizione molecolare permette inoltre il reclutamento dei pazienti per futuri trials terapeutici (come già accaduto per il trial sull’acido ascorbico in pazienti con CMT1A), aprendo interessanti prospettive terapeutiche ai pazienti affetti da queste frequenti forme di neuropatia.
